Nová verze SALSA® MLPA® probemix P008-C1 PMS2
Katalogová čísla:
- P008-025R: SALSA® MLPA® probemix P008 PMS2, 25 reakcí.
- P008-050R: SALSA® MLPA® probemix P008 PMS2, 50 reakcí.
- P008-100R: SALSA® MLPA® probemix P008 PMS2, 100 reakcí.
Novou verzi kitu využijete v kombinaci s reagenčním SALSA® MLPA® kitem, dostupný pro různý počet reakcí. MLPA reagenční kity jsou k dispozici s FAM nebo Cy5.0 značenými primery, vhodné pro kapilární sekvenátory Applied Biosystems a Beckman.
Certifikát analýzy: Informace o podmínkách skladování, testech kvality a vzoru elektroforeogramu z aktuální šarže je k dispozici na mlpa.com.
Pouze pro profesionální použití. Vždy si před použitím pročtěte nejnovější popis produktu a MLPA obecný protokol. Je odpovědností uživatele, aby se seznámil s nejnovějšími vědeckými poznatky, než bude vyvozovat závěry z výsledků získaných s tímto produktem.
Účel použití
Salsa MLPA kit P008 PMS2 je test pro in vitro diagnostiku (IVD)1 nebo pouze pro výzkumné účely (RUO) a slouží pro detekci delecí nebo duplikací v exonu 1-11 genu PMS2 a delecí nebo duplikací v exonu 12-15 genu PMS2 nebo PMS2CL s cílem potvrdit možnou příčinu a klinickou diagnózu Lynchova syndromu nebo syndromu MMR-deficience. Tento produkt může být také použit pro molekulární genetické testování u rodinných příslušníků s rizikem onemocnění. Tento test je určen pro použití s lidskou DNA izolovanou z periferní krve, a ne pro použití s DNA izolovanou z čerstvého nádoru nebo tkáních fixovaných ve formalínu a zalitých v parafínu.
Tento test není určen k použití jako samostatný test pro klinické rozhodování. Výsledky tohoto testu interpretujte molekulárním genetikem nebo ekvivalentním odborníkem.
Klinické pozadí
Heterozygotní zárodečné mutace v genu PMS2 (gen pro opravu chybného párování) jsou možnou příčinou Lynchova syndromu (LS, také nazývaný jako dědičná predispozice k nepolypóznímu kolorektálnímu nádoru - HNPCC), což je autozomálně dominantní choroba. LS je dědičná rakovina trávicího traktu, zejména tlustého střeva a konečníku. Kromě toho zvyšuje riziko mnoha jiných druhů nádorů kvůli poškozené opravě.
Mezi různými defekty v genu PMS2, které byly nalezeny u pacientů, jsou delece a duplikace celých exonů, které obvykle nejsou detekovány standardní sekvenační analýzou. Technika MLPA může zjistit většinu těchto delecí a duplikací, a proto doplňuje sekvenační analýzu genu PMS2.
10 až 20 % případů LS je způsoben mutacemi PMS2 a MSH6. 80 až 90 % případů je způsobeno mutacemi v MLH1 nebo MSH2 a 3 % případů jsou způsobeny mutacemi v EPCAM (Tiwari et al., 2016).
- Absence nebo deaktivace obou alel PMS2, která vede k dětské rakovině střev a polypóze (konstituční syndrom MMR-deficience, CMMR-D), byly popsány, ale jsou extrémně vzácné (Herkert et al., 2011).
Struktura genu a transkripční varianty
PMS2 gen pokrývá 36 kb na chromozómu 7p22.1. Jedna hlavní varianta transkriptu byla popsána zde. Tato sekvence NM_000535.6 (5156 nt; kódovací sekvence 88-2676) je referenčním standardem v projektu NCBI RefSeqGene. V tabulce 2 jsou místa ligace sond PMS2 označena podle této sekvence, která obsahuje 15 exonů. ATG translační počátek je umístěn v exonu 1. PMS2 LRG_161 je k dispozici na této adrese a je totožný s GenBank NG_008466.1.
Analýza mutací PMS2 je komplikovaná kvůli přítomnosti více pseudogenů. Jeden z těchto pseudogenů, PMS2CL, má téměř 100% sekvenční identitu s PMS2 exony 12-15 a nachází se ve vzdálenosti jen 760 kb od PMS2. Pro exony 1-5 PMS2 existuje velké množství různých pseudogenů, z nichž každý má velmi vysokou sekvenční homologii se skutečným genem.
Číslování exonů
Číslování exonů použité v tomto popisu kitu P008-C1 PMS2 a v analýze listu Coffalyser.Net je tradiční číslování exonů, které je identické s číslováním v PMS2 LRG_161.
Obsah P008 PMS2 kitu
Obsahuje 47 sond s amplifikační produkty mezi 128 a 483 nt
- 34 sond pro gen PMS2/PMS2CL,
- 13 referenčních sond detekující sekvence mimo tuto oblast.
Detekce abnormálních počtu kopií PMS2 exonů je komplikovaná kvůli existenci mnoha pseudogenů. U exonů 12-15 neexistují žádné spolehlivé sekvenční rozdíly mezi PMS2 a PMS2CL pseudogenem (van der Klift et al., 2010). V důsledku toho není možné navrhnout sondy MLPA, které jsou 100% specifické pro tyto exony PMS2. Avšak kombinovaný počet kopií PMS2 a PMS2CL je velmi konzistentní u zdravých jedinců. Z tohoto důvodu je zahrnuto pět sond, které detekují sekvence přítomné v exonech 12-15 jak PMS2, tak PMS2CL.
Vzhledem k tomu, že tyto sondy detekují oba geny, normální jedinec má 4 kopie na buňku a delece nebo duplikace jedné kopie vede ke koeficientu sondy 0,75 nebo 1,25. Spolu se sondami pro exony 1-11 by analýza těchto sond měla vyloučit změny počtu kopií PMS2 ve velké většině testovaných vzorků.
V případě, že jedna nebo více z těchto pěti sond indikuje změnu počtu kopií v oblasti exonu 12-15, mělo by být určeno, zda je změna počtu kopií v PMS2 nebo v PMS2CL. K tomu je zahrnuto 10 sond, které detekují počet kopií obou alelických forem pěti SNP v exonech 11-15 PMS2 / PMS2CL. Distribuce těchto SNP alel mezi PMS2 a PMS2CL se liší. Další informace naleznete v části "Interpretace výsledků" a v příloze. Analýza těchto SNP-specifických sond doplněná o genově specifickou dlouhou PCR a sekvenování (příští generace) může poskytnout další indikace, zda je změna počtu kopií exonů 12-15 v genu PMS2 nebo v PMS2CL (Li et al., 2025, Vaughn et al., 2011). Jak uvádí Vaughn a kol. (2011 a 2013), velká většina delecí zjištěných u exonů 12-15 je ve skutečnosti lokalizována v genu PMS2.
Tento kit obsahuje devět kontrolních fragmentů, které generují amplifikační produkty mezi 64 a 105 nt:
- čtyři DNA kvantitativní fragmenty (Q-fragmenty),
- tři DNA denaturační fragmenty (D-fragmenty),
- eden chromozóm X, j
- eden chromozóm Y-specifický fragment.
Q-fragmenty jsou viditelné pouze, pokud je použito méně než 100 ng DNA vzorku. Nízký signál 88 nebo 96 nt fragmentu naznačuje neúplnou DNA denaturaci. Více informací o tom, jak interpretovat výsledky z těchto kontrolních fragmentů, můžete nalézt v MLPA obecném protokolu.
Validace MLPA metody
Interní validace MLPA metody na 16 vzorcích DNA ze zdravých jedinců je nezbytná, a to zejména při prvním použití MLPA, nebo při změně zpracování vzorků, metodě extrakce DNA nebo používaného přístroje. Tato validace by měla vykazovat standardní odchylku <0,10 pro všechny sondy (s výjimkou 10 SNP-specifických sond) v experimentu.
Požadavky na vzorky
Referenční vzorky
Referenční vzorky DNA by měly být odvozeny ze stejného typu tkáně, zpracovány za použití stejného postupu a připraveny za použití stejného způsobu, jako je například extrakce DNA ze vzorku pacienta. Referenční vzorky by měly být odvozeny od nepříbuzných jedinců, kteří jsou z rodin bez historie predispozice k hereditárním nádorům. Další informace týkající se výběru a použití referenčních vzorků lze nalézt v MLPA obecném protokolu.
Výběr vhodných referenčních vzorků pro kit P008 PMS2 je komplikovaný kvůli přítomnosti 10 SNP-specifických sond v tomto kitu. Podle našich zkušeností má pouze 25 % normálních vzorků dvě kopie pro každý z 10 cílových SNP a mohou být použity jako referenční vzorky.
SALSA Reference Selection DNA SD072
Pro určité aplikace je výběr vhodných referenčních DNA vzorků komplikovaný. Referenční vzorek DNA pro tento kit (katalogové číslo SD072) lze objednat od společnosti MRC-Holland.
SALSA Reference Selection DNA SD072 může být použita pro nalezení vhodného referenční vzorku DNA z vašeho vlastního souboru vzorků pro použití v dalších experimentech MLPA. Velmi doporučujeme použít vzorky DNA a referenční vzorky DNA izolované stejnou metodou a odvozené od stejného zdroje tkáně. Doporučujeme použít Selection DNA SD072 pouze pro počáteční experimenty na vzorcích DNA zdravých jedinců s cílem identifikovat vhodné referenční DNA vzorky. SD072 by neměla být použita jako referenční vzorek ve všech experimentech. Tento produkt, při použití v kombinaci s P008, je určen pro in vitro diagnostické (IVD) účely, jak je uvedeno na certifikátu analýzy a popisu produktu SD072.
Charakteristika výkonu testu
Velké delece představují 22-37 % variant v PMS2, které způsobují Lynchův syndrom (Brea-Fernandez et al., 2014, Senter et al., 2008, Vaughn a kol., 2010, Wernstedt a kol., 2012). Frekvence delecí PMS2 u pacientů s CMMR-D je 7 % (Herkert et al., 2011). Analytická citlivost a specifita (podle přehledu literatury 2005-2016) pro detekci delecí nebo duplikací v exonech 1-11 PMS2 a detekci delecí nebo duplikací v exonech 12-15 PMS2 nebo PMS2CL je velmi vysoká a lze ji považovat za> 99 %.
Analytická výkonnost může být ohrožena
- SNP nebo dalšími polymorfismy (např. indels) v cílové sekvenci DNA,
- nečistotami ve vzorku DNA,
- neúplnou DNA denaturací,
- použitím nedostatečného nebo příliš velkého množství vzorku DNA,
- použitím nedostatečných nebo nevhodných referenčních vzorků,
- problémy s kapilární elektroforézou nebo špatným postupem normalizace dat a dalšími technickými chybami.
Analýza dat
Coffalyser.Net software musí být použit pro analýzu dat v kombinaci s listem pro specifickou šarži - MLPA Coffalyser list. Použití jiného ne-proprietárního softwaru může vést k neprůkazným nebo falešným výsledkům. Pro více informací o MLPA kontrole kvality a analýze dat, viz Coffalyser.Net Manual.
Interpretace výsledků
U PMS2 sond pro exony 1-10, stejně jako pro dvě sondy pro exon 11, očekávané výsledky pro MLPA sondy specifické pro oblast PMS2 jsou počty kopií alel 0 (velmi vzácná homozygotní delece), 1 (heterozygotní delece), 2 (normální), 3 (heterozygotní duplikace) a občas 4 (heterozygotní triplikace nebo homozygotní duplikace).
Pět sond pro exony 12-15 detekuje sekvenci, která je přítomná v genu PMS2 a i jeho pseudogenu PMS2CL. U těchto 5 sond je poměr 1,00 po analýze odpovídající přítomnosti 4 kopií / buňka (normální). Heterozygotní delece nebo duplikace buď PMS2 nebo PMS2CL vede k hodnotám 0,75 nebo 1,25. Heterozygotní delece nebo duplikace PMS2 a PMS2CL, nebo homozygotní delece nebo duplikace PMS2 nebo PMS2CL (extrémně vzácné), bude mít za následek hodnoty 0,5 nebo1,5.
Deset sond je přítomno pro každou alelu z 5 různých polymorfních sekvencí v exonech 11-15. Protože tyto SNP jsou přítomné jak v PMS2, tak v PMS2CL, počet kopií detekovaných těmito sondami u normálních jedinců může být 0, 1, 2, 3 nebo 4. Kombinovaný počet kopií dvou sond jedné dvojice sond SNP by měl být 4 u normálních jedinců. Tyto SNP-specifické sondy se používají pouze v kombinaci s jinými technikami, jako je dlouhá PCR, aby bylo možné zjistit, zda jsou změny počtu kopií v PMS2 nebo PMS2CL.
Šest SNP-specifických sond v exonech 13-15 poskytuje extrémně proměnlivé výsledky, pouze 25% normálních vzorků mají počet kopií 2 pro každou alelu těchto tří SNP. Naopak, čtyři SNP-specifické sondy v exonu 11 a intronu 12 vykazují abnormální počet kopií u méně než 2% testovaných vzorků. Tyto sondy 165 nt a 238 nt indikují počet kopií PMS2 ve většině vzorků, zatímco sondy 171 nt a 244 nt jsou orientační pro počet kopií PMS2CL. U některých vzorků je však sekvence PMS2 přítomna také v PMS2CL nebo naopak, což vede k hodnotě 0,5 pro jednu sondu a 1,5 pro druhou sondu tohoto páru SNP-sondy.
Standardní odchylka všech sond v referenčních vzorcích by měla být <0,10 a kvocient dávky (DQ) referenčních sond ve vzorcích pacientů by měl být mezi 0,80 a 1,20. Pokud jsou tato kritéria splněna, následující mezní hodnoty pro DQ sond (u těchto se očekává, že mají počet kopií 2) mohou být použity k interpretaci výsledků MLPA:
Uspořádání sond podle chromozomální polohy usnadňuje interpretaci výsledků a může odhalit menší změny, jako jsou změny pozorované v případech mozaiky. Analýza rodičovských vzorků může být nezbytná pro správnou interpretaci komplexních výsledků.
Falešně pozitivní výsledky
Vezměte prosím na vědomí, že abnormality zjištěné jedinou sondou (nebo více po sobě jdoucích sond) mají stále značnou šanci být falešně pozitivní výsledek. Neúplná DNA denaturace (například z důvodu kontaminace solí) může vést ke snížení signálu sondy, zejména u sond umístěných v CpG ostrově nebo v blízkosti genu PMS2. Použití dalšího kroku čištění nebo alternativní metody extrakce DNA může takové případy vyřešit.
Falešné pozitivní výsledky - duplikace
Kontaminace DNA vzorků cDNA nebo PCR amplikony z jednotlivých exonů mohou vést k falešně pozitivním duplikacím (Varga et al., 2012). Analýza nezávisle odebraného vzorku sekundární DNA může vyloučit tento typ artefaktů.
- Normální počty kopií variant u zdravých jedinců jsou popsány v databázi genomových variant. Uživatelé by měli vždy konzultovat nejnovější aktualizaci databáze a vědecké poznatky při interpretaci jejich výsledků.
- Ne všechny odchylky zjištěné MLPA jsou patogenní. V některých genech, intragenové delece jsou známy a vedou k velmi mírné nebo žádné chorobě (Schwartz et al., 2007). Pro mnoho genů, existuje více než jedna transkripční varianta. Změny v počtu kopií exonů, které nejsou přítomny ve všech transkripčních variantách, nemusí mít klinický význam. Duplikace, které zahrnují první nebo poslední exon genu (například exony 1-3), mohou v některých případech mít za následek inaktivaci této kopie genu.
- Změny v počtu kopií detekované referenčními sondami nebudou mít pravděpodobně žádný vztah k testovanému onemocnění.
Limitace metody
- Ve většině populací jsou hlavní příčinou genetických defektů v PMS2 genu malé (bodové) mutace, z nichž žádná nebude detekována pomocí MLPA kitu P008 PMS2.
- MLPA nemůže zjistit žádné změny, které leží mimo cílovou sekvenci sond a nezjistí počet kopií neutrální inverze nebo translokace. I když MLPA nedetekuje žádné aberace, zůstává možnost, že existují biologické změny v tomto genu nebo chromozomální oblasti, ale zůstávají nedetekované.
- Změny sekvence (např. SNP, bodové mutace, malé indels) v cílové sekvenci sondy mohou způsobit falešně pozitivní výsledky. Mutace / SNP (i když> 20 nt od ligačního místa sondy) může snižovat signál sondy tím, že brání ligaci oligonukleotidové sondy nebo destabilizuje vazbu sondy na DNA.
Potvrzení výsledků
V případě změn počtu kopií zjištěných v exonech 12-15 výsledky MLPA neindikují, zda je delece nebo duplikace přítomna v PMS2 nebo v PMS2CL. Pro stanovení zda je změna počtu kopií v PMS2 nebo PMS2CL, MLPA může být doplněna genově specifickou dlouhou PCR, následovanou sekvenováním (příští generace)(Li et al., 2015, Vaughn a kol., 2011). MLPA určí počet kopií pro každou z alelických variant detekovaných kitem P008-C1. Sekvenační analýza následně ukáže, které alelické varianty jsou přítomny v PMS2 a PMS2CL. Kombinací těchto informací je možné zjistit, zda je změna počtu kopií v PMS2 nebo v PMS2CL. Více informací týkajících se tohoto přístupu a vhodné páry PCR primerů pro dlouhou PCR lze nalézt v publikaci Vaughn et al. 2011 a Li et al. 2015.
Databáze PMS2 mutací
Důrazně doporučujeme uživatelům ukládat pozitivní výsledky do databáze LOVD Mezinárodní společnosti pro gastrointestinální dědičné nádory (INSiGHT). Doporučení pro nomenklaturu popisující delece / duplikace jednoho nebo více exonů lze nalézt na této adrese. Prosím, oznamte změny v počtu kopií detekované referenčními sondami, falešně pozitivní výsledky kvůli SNP a neobvyklé výsledky (například duplikace PMS2 exonů 6 a 8, ale ne exonu 7) do MRC-Holland.
(a) Číslování exonů použité v tomto popisu kitu P008-C1 PMS2 a v analýze listu Coffalyser.Net je tradiční číslování, které je použito v PMS2 LRG_161.
(a) Číslování exonů použité v tomto popisu kitu P008-C1 PMS2 a v analýze listu Coffalyser.Net je tradiční číslování, které je použito v PMS2 LRG_161.
(b) Ligační místa P008 PMS2 jsou označeny podle Refseq sekvence NM_000535.6 obsahující 15 exonů.
(c) Pouze část sekvence sond je uvedena. Kompletní sekvence sond jsou k dispozici na www.mlpa.com. Prosím, dejte nám vědět, pokud najdete nějaké chyby.
+ Detekuju PMS2 a jeho pseudogen PMS2CL.
~ Šedé kolonky: těchto deset sond detekuje SNP, který je přítomen ve dvou alelických formách. Kvůli časté genové konverzi nemohou být tyto sondy věrohodně přiřazeny k PMS2 nebo k jeho pseudogenu PMS2CL (zejména sondy pro exony 13, 14 a 15). Je-li kombinovaný počet kopií dvou alel čtyři, delece nebo duplikace je nepravděpodobná. Páry sond pro exon 11 (165 nt a 171 nt) a intron 12 (238 nt a 244 nt) jsou stabilnější. Sondy 165 nt a 238 nt zřejmě indikují počet kopií PMS2 ve většině případů, zatímco dvě sondy 171 nt a 244 nt označené kurzívou zřejmě ukazují počet kopií PMS2CL. Mějte prosím na paměti, že ke konverzi genů může dojít také u těchto párových sond, a že získané výsledky by měly být vždy potvrzeny.
± Dvě sondy pro exon 5 generují (limitovaný) signál na jednom z mnoha pseudogenů PMS2. Když byl testován vzorek s homozygotní delecí PMS2, sonda 232 nt exonu 5 generovala signál ~ 10% normálního signálu, zatímco sonda 454 nt exonu 5 generovala signál ~ 20% normálního signálu. U vzorků s heterozygotní delecí PMS2 exonu 5, očekáváme signál ~ 60-70% normálního signálu pro tyto sondy. Delece nebo duplikace exonu 5 by měly být dále zkoumány, pouze pokud obě sondy pro exon 5 vykazují stejný výsledek.
# Specificita této sondy závisí na rozdílu 1 nt s pseudogenem. Zvýšení signálu pouze této sondy může být důsledkem změny sekvence v pseudogenu (falešně pozitivní duplikace).
Δ Delece nebo duplikace exonu 3 by měla být dále zkoumána, pouze pokud obě sondy pro exon 3 vykazují stejný výsledek.
 |
 |
- Delece PMS2 exon 7-8.
- Delece exon 14. Kit P008 nemůže stanovit, zda je delece přítomna v PMS2 nebo v PMS2CL. Toto je třeba dále zkoumat pomocí následných studií.
- Delece PMS2 exon 10.
- Duplikace PMS2 exon 7-14.
- Delece PMS2 exon 9-15.
- Delece PMS2 exon 1-14
- Delece PMS2 exon 11-15.
- Delece PMS2 exon 5-15.
- Delece exon 13-14. Kit P008 nemůže stanovit, zda je delece přítomna v PMS2 nebo v PMS2CL. Toto je třeba dále zkoumat pomocí následných studií.
